Characterization of the intracellular acidity regulation capacity of brain tumor cells in fluorescence imaging-Consequences for therapeutic optimization oftemozolomide
Caractérisation de la capacité de régulation de l'acidité intracellulaire des cellules de tumeurs cérébrales en imagerie par fluorescence-Conséquences pour l'optimisation thérapeutique du témozolomide
Résumé
A well-known feature of tumor cells is high glycolytic activity leading to acidification ofthe tumor microenvironment through extensive lactate production. This acidosis promotesprocesses such as metastasis, aggressiveness and invasiveness that has been associated to a worse clinical prognosis. Moreover, the function and/or expression of transporters involved in regulation of intracelluar pH (pHi) might be altered.In this context, the aim of this thesis was first to characterize the capacity of a tumor toregulate intracellular acidity by measuring the pHi of two glioma cell lines: the F98 cell line (rat glioma) and the U87-MG cell line (human glioblastoma). Therefore, we have developed a new ratiometric method that allows the combination of pH-sensitive fluorescent probes and confocal microscopy to characterize the pHi regulatory capacity and pH resistance of F98 and U87 cell lines in 2D monolayer cultures and in 3D spheroids. This method makes it possible to best exploit the capacities of the confocal microscope.Our result show that the tumor regulation of acidity is not the same for the two cell linesand as a consequence, our results do not support the common idea that tumor cells behave in a similar way. On the other hand, pHi regulation appears highly cell-dependent. In 2D monolayer cultures, we have found that F98 rat glioma cells do not regulate intracellular acidity and may preserve protons inside the cells by activating the V-ATpase pump at acidic pH to bring H+ ions into lysosomes. However, we have found that human glioblastoma U87 cells are able to regulate intracellular acidity and may use the Na+/H+ exchanger to export H+ ions outside the cells. Comparison of the measurements performed on 2D monolayer cultures and 3D spheroids exhibits some differences. Our results show that extracellular acidity may inhibit energy metabolism or protein synthesis and prevent the regulation of exchanges such as Na+/H+ in 3D spheroids.Another aim of the thesis was to assess the efficacy of Temozolomide (TMZ). TMZ is the cornerstone drug used against brain tumors. It has the particularity to be highly pH-dependent. Therefore, the effect of TMZ was studied on our two cell lines by manipulating the extracellular pH (pHe). The results has allowed us to show that drug efficiency depend on the celltype and on the pHe, which gives an argument for considering pH as a personalized therapeutic target for future research based on the combination of TMZ with pH-regulating agents.Based on our original results, we found that the use of our developed fluorescent method can be a valuable tool to assess metabolic status in glioma models and can therefore be used to characterize cells from patient biopsies to better adapt the therapy.
Une caractéristique bien connue des cellules tumorales est une activité glycolytique élevée conduisant à une acidification du microenvironnement tumoral par une production importante de lactate. Cette acidose favorise des processus tels que les métastases, l'agressivité et le caractère invasif qui ont été associés à un pronostic clinique moins bon. De plus, la fonction et/ou l'expression des transporteurs impliqués dans la régulation du pH intracellulaire (pHi) pourraient être altérées.Dans ce contexte, l'objectif de cette thèse a d'abord été de caractériser la capacité d'une tumeur à réguler l'acidité intracellulaire par la mesure du pHi de deux lignées cellulaires de gliome : la lignée cellulaire F98 (gliome de rat) et la lignée cellulaire U87 MG (glioblastome humain). Par conséquent, nous avons développé une nouvelle méthode ratiométrique qui permet la combinaison de sondes fluorescentes sensibles au pH et de la microscopie confocale pour caractériser la capacité de régulation du pHi et la résistance au pH des lignées cellulaires F98 et U87 dans des cultures monocouches 2D et dans des sphéroïdes 3D. Cette méthode permet d'exploiter au mieux les capacités du microscope confocal.Nos résultats montrent que la régulation tumorale de l'acidité n'est pas la même pour les deux lignées cellulaires et, par conséquent, nos résultats ne soutiennent pas l'idée courante selon laquelle les cellules tumorales se comportent de manière similaire. D'autre part, la régulation du pHi apparaît fortement dépendante des cellules. Dans les cultures monocouches 2D, nous avons trouvé que les cellules de gliome de rat F98 ne régulent pas l'acidité intracellulaire et peuvent préserver les protons à l'intérieur des cellules en activant la pompe V-ATpase à pH acide pour amener les ions H+ dans les lysosomes. Cependant, nous avons trouvé que les cellules humaines de glioblastome U87 sont capables de réguler l'acidité intracellulaire et peuvent utiliser l'échangeur Na+/H+ pour exporter les ions H+ à l'extérieur des cellules. La comparaison des mesures effectuées sur des cultures monocouches 2D et des sphéroïdes 3D présente quelques différences. Nos résultats montrent que l'acidité extracellulaire peut inhiber le métabolisme énergétique ou la synthèse protéique et empêcher la régulation des échanges tels que Na+/H+ dans les sphéroïdes 3D.Un autre objectif de la thèse était d'évaluer l'efficacité du Temozolomide (TMZ). Le TMZ est le médicament de base utilisé contre les tumeurs cérébrales. Il a la particularité d'être fortement dépendant du pH. Par conséquent, l'effet du TMZ a été étudié sur nos deux lignées cellulaires en manipulant le pH extracellulaire (pHe). Les résultats nous ont permis de montrer que l'efficacité des médicaments dépend du type cellulaire et du pHe, ce qui donne un argument pour considérer le pH comme une cible thérapeutique personnalisée pour de futures recherches basées sur la combinaison de TMZ avec des agents régulateurs de pH.Sur la base de nos résultats originaux, nous avons trouvé que l'utilisation de notre méthode fluorescente développée peut être un outil précieux pour évaluer l'état métabolique dans les modèles de gliome et peut donc être utilisée pour caractériser les cellules des biopsies de patients afin de mieux adapter la thérapie
Origine : Version validée par le jury (STAR)